Пад рэдакцыяй Пітэра Сарнова, Медыцынская школа Стэнфардскага універсітэта, Стэнфардскі ўніверсітэт, Каліфорнія, зацверджана 25 снежня 2020 г. (разгледжана 25 кастрычніка 2020 г.)
Мы паведамляем пра ўзаемадзеянне паміж субадзінак пры рэплікацыі транскрыпцыйных комплексаў каранавірусаў, якія важныя для рэплікацыі і эвалюцыйнага захавання.Мы прадставілі доказы таго, што дамен NiRAN, звязаны з nsp12, мае трансферазную актыўнасць нуклеазідмонафасфату (NMP), і вызначылі nsp9 (РНК-звязваючы бялок) у якасці сваёй мішэні.NiRAN каталізуе кавалентнае далучэнне часткі NMP да кансерватыўнага амінаканца nsp9 у рэакцыі, якая абапіраецца на іёны Mn2+ і прылеглыя кансерватыўныя рэшткі Asn.Высветлілася, што актыўнасць NiRAN і NMPylation nsp9 важныя для рэплікацыі каранавіруса.Дадзеныя дазваляюць нам звязаць гэтую актыўнасць ферментнага маркера ўкладзенага віруса з папярэднімі назіраннямі ў гіпотэзе аб тым, што ініцыяцыя сінтэзу РНК у класе РНК-вірусаў функцыянальна і эвалюцыйна адпавядае.
РНК-залежная РНК-палімераза (RdRps) сямействаў Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae і 12 іншых) звязана з амінаканцавым (N-канцавым) даменам у неструктурным бялку (nsp), які вылучаецца з поліпратэіна, які называецца NiRAN 1ab складаецца з галоўнай віруснай пратэазы (Mpro).Раней паведамлялася пра ўласную актыўнасць GMPylation/UMPylation артэрыяльнага віруса NiRAN-RdRp nsp, і было прапанавана стварыць пераходны працэс для перадачы нуклеазідмонафасфату (NMP) у (на дадзены момант невядомы) вірус і/або клеткавую біяпалімерызацыю Things.Тут мы паказваем, што каранавірус (каранавірус чалавека [HCoV]-229E і каранавірус цяжкага вострага рэспіраторнага сіндрому 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) мае Mn2+-залежную актыўнасць NMPylation, якая паходзіць ад nsp9 шляхам утварэння Mpro-апасродкаванага nsp9 пасля N-канцавы фланкіруючы nssp пратэялітычна вызваляецца, фасфарамідат злучаецца з першасным амінам (N3825) на N-канцы nsp9.Урыдзінтрыфасфат з'яўляецца пераважным нуклеатыдам у гэтай рэакцыі, але аденозинтрифосфат, гуанозінтрыфасфат і цитидинтрифосфат таксама з'яўляюцца прыдатнымі сусубстратамі.Даследаванні мутацый з выкарыстаннем рэкамбінантных бялкоў каранавіруса nsp9 і nsp12 і генна-інжынерных мутантаў HCoV-229E вызначылі рэшткі, неабходныя для NiRAN-апасродкаванай NMP-піляцыі nsp9 і рэплікацыі віруса ў культуры клетак.Дадзеныя пацвердзілі прадказанне рэшткаў актыўнага сайта NiRAN і вызначылі важную ролю рэшткаў nsp9 N3826 у NMP-піляванні nsp9 і рэплікацыі віруса in vitro.Гэты астатак з'яўляецца часткай кансерватыўнай N-канцавой трыпептыднай паслядоўнасці NNE і апынуўся адзіным нязменным астаткам nsp9 і яго гамолагаў у сямействе каранавірусаў.Гэта даследаванне забяспечвае трывалую аснову для функцыянальнага вывучэння актыўнасці NMPylation іншых укладзеных вірусаў і прапануе магчымыя мэты для распрацоўкі супрацьвірусных прэпаратаў.
Вірус станоўчай ланцуговай РНК Nidovirales заражае мноства пазваночных і бесхрыбтовых (1, 2).У цяперашні час парадак уключае 14 сем'яў (3), з якіх сямейства каранавірусаў шырока вывучалася за апошнія 20 гадоў.У той час тры зоанозных коронавируса выйшлі з жывёл-гаспадароў і выклікалі буйнамаштабныя ўспышкі цяжкіх рэспіраторных інфекцый у людзей.У тым ліку ўстойлівыя пандэміі, выкліканыя цяжкімі вострымі інфекцыйнымі захворваннямі.Рэспіраторны сіндром каранавіруса 2 (ВРВІ-CoV-2) (4âââ7).Нідавірусы маюць агульную арганізацыю геному, і субадзінак звязанага з мембранай рэплікацыйна-транскрыпцыйнага комплексу (RTC) закадаваны ў 5-?²-канцавых дзвюх трацінах і асноўнай структурнай субадзінцы віруснай часціцы, а таксама некаторых дадатковых кампанентах .Бялок, закадаваны ў 3??² канцавой траціне геному (1).За выключэннем аднаго сямейства планарий (Monoviridae) (8), усе ўкладзеныя вірусы кадуюць RTC субадзінак у дзвюх вялікіх адкрытых рамках счытвання (ORF) ORF1a і ORF1b, якія транслююцца з геномнай РНК.ORF1a кадуе поліпратэін (pp) 1a, а ORF1a і ORF1b сумесна кадуюць pp1ab.Пры агульным удзеле асноўнай пратэазы (Mpro), кадаванай ORF1a, і pp1a, і pp1ab пратэялітычна ператвараюцца ў розныя неструктурныя вавёркі (nsps), таксама вядомыя як 3CLpro, таму што яны маюць гамолагі з 3Cpro пікарнавіруса ( 9).Мяркуецца, што гэтыя nsps сабраны ў вялікі дынамічны RTC, каталізуюць сінтэз геномнай РНК (рэплікацыя) і набору субгеномных РНК (транскрыпцыя) і выкарыстоўваюцца для каардынацыі экспрэсіі ORF, размешчанай ніжэй па плыні ORF1b (10?? ?12).
Асноўны RTC уключае РНК-залежную РНК-палімеразу (RdRp) (13), геліказу надсямейства 1 (HEL1) (14, 15) і некалькі ферментаў працэсінгу РНК, якія ў асноўным кадуюцца ў ORF1b і ў сямействе каранавірусаў. Ён змяшчае nsp12-nsp16 і nsp9-nsp12 у сямействе Arterioviridae (гл. спасылку 10ââ 12).RdRp і HEL1 прадстаўляюць два (адну пятую) захаваных даменаў віруса птушынага гнезда і маюць гамолагі сярод іншых РНК-вірусаў.Мяркуецца, што рэпліказе ядра дапамагаюць іншыя субадзінкі, у тым ліку некалькі невялікіх nssp, якія выдзяляюцца з карбокси-канцавой (C-канцавой) вобласці pp1a, ніжэй па плыні Mpro (каранавірус nsp5 і артэрыяльны вірус nsp4 адпаведна).Яны маюць абмежаваную абарону, прывязаную да сям'і, і разнастайныя віды дзейнасці (разгляд у спасылцы 10ââ12).
Адносна нядаўна дамен з унікальнымі характарыстыкамі матыву паслядоўнасці быў знойдзены на амінакісным канцы (N-канец), прылеглым да RdRp, ва ўсіх укладзеных вірусах, але не ў іншых РНК-вірусах (16).Зыходзячы з яго месцазнаходжання і актыўнасці нуклеатыд-трансферазы (нуклеазідмонафасфат [NMP] трансферазы), гэты дамен атрымаў назву NiRAN (звязаная з Nestvirus RdRp нуклеатыд-трансфераза).Двухдаменная камбінацыя NiRAN-RdRp складае nsp12 у сямействе Coronaviridae і nsp9 у сямействе Arterioviridae, а ў іншых nestoviridae чакаецца, што NiRAN-RdRp будзе вылучацца як незалежны nsp з віруснага поліпратэіна.У каранавірусе дамен NiRAN змяшчае ??1/450 астаткаў і злучаны з C-канцавым даменам RdRp праз вобласць лінкера (16?19).У вірусе артэрыіту коней (EAV) (Arteriviridae) рэкамбінантны nsp9 дэманструе залежную ад іёнаў Mn2+ (самастойную) актыўнасць UMPylation і GMPylation, якая залежыць ад трох захаваных асноў паслядоўнасці ў неставірусе, AN, BN і CN. Рэшткі ў паслядоўнасці.Дзе N азначае NiRAN) (16).N-канцавое фланкаванне гэтых матываў з'яўляецца менш кансерватыўным матывам preAN.Некаторыя з гэтых рэшткаў таксама захоўваюцца ў аддалена роднасных пратэінкіназах, дзе было паказана, што яны ўдзельнічаюць у звязванні нуклеазідтрыфасфату (NTP) і каталітычнай актыўнасці (20, 21).У адпаведнасці з гэтым назіраннем некалькі ключавых рэшткаў актыўнага цэнтра ў псеўдакіназе SelO з Pseudomonas syringae можна сабраць з нядаўна апублікаваным суперкомплексам SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Кансерваваныя рэшткі каранавіруса NiRAN, накладзеныя на электронную мікраструктуру.Рэкамбінантны бялок (17).Мяркуецца, што задакументаванае (сама) U/GMPylation прывядзе да пераходнага стану для перадачы NMP на (у цяперашні час невядомы) субстрат (16), і структурнае падабенства паміж NiRAN і протеинкиназой (17, 19) Гіпотэза, што NiRAN мадыфікуе іншыя бялкі.
Многія асаблівасці, у тым ліку унікальная і унікальная сістэматычная сувязь з укладзенымі вірусамі і генетычнае аддзяленне ад RdRp, робяць NiRAN разумным ключавым рэгулятарным ферментам для ўкладзеных вірусаў, што мае вырашальнае значэнне для іх з'яўлення і ідэнтычнасці.Раней называліся тры магчымыя функцыі з удзелам NiRAN для рэгулявання геномнай/субгеномнай трансляцыі або рэплікацыі/транскрыпцыі.Пры разглядзе недахопу і няпоўных дадзеных, даступных у той час, кожная функцыя мае свае перавагі і недахопы (16).У гэтым даследаванні мы імкнемся аб'яднаць біяхімічныя і зваротныя генетычныя даследаванні каранавірусаў, якія прадстаўляюць два роды, і паставіць нашы высновы на эвалюцыйны фон натуральнай мутацыі сямейства каранавірусаў, каб атрымаць уяўленне аб гэтай таямнічай сферы.Мы паведамляем пра сур'ёзныя поспехі ў разуменні NiRAN праз ідэнтыфікацыю натуральных мішэняў у RTC, што (сярод трох даступных гіпотэз) спрыяе ролі гэтага дамена ў ініцыяванні сінтэзу ўкладзенай віруснай РНК.Гэта даследаванне таксама адкрывае магчымасці для іншых роляў NiRAN на інтэрфейсе хаста віруса.
Каб ахарактарызаваць ферментатыўныя ўласцівасці дамена NiRAN, звязанага з каранавірусам nsp12, мы вырабілі рэкамбінантную форму каранавіруса чалавека 229E (HCoV-229E) nsp12 у E. coli з пазнакай His6 на С-канцы і аб'ядналі бялок з [α32-P] Інкубуйце разам з NTP у прысутнасці MnCl2, як апісана ў матэрыялах і метадах.Аналіз прадукту рэакцыі паказаў прысутнасць пазначанага радыеактыўнай пазнакай бялку, які мігруе разам з nsp12 (106 кДа), што паказвае на тое, што nsp12 каранавіруса каталізуе адукацыю кавалентных аддуктаў бялок-NMP, пераважна ўтвораных з урыдзінамонафасфатам (UMP) (малюнак 1A) і Б).Колькасны аналіз паказаў, што ў параўнанні з іншымі нуклеатыдамі інтэнсіўнасць сігналу ўключэння UMP павялічылася ў 2-3 разы (малюнак 1C).Гэтыя дадзеныя супадаюць з прагназаванай актыўнасцю трансферазы NMP дамена NiRAN каранавіруса (16), але паказваюць, што нуклеатыдныя перавагі дамена NiRAN каранавіруса і артэрыяльнага віруса адрозніваюцца.
Актыўнасць самапілявання HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 кДа) інкубавалі з прызначаным [α-32P] NTP у прысутнасці 6 мм MnCl2 на працягу 30 хвілін (падрабязней гл. Матэрыялы і метады).Прадукты рэакцыі падзялялі з дапамогай SDS-PAGE і афарбоўвалі Кумасі бліскучым сінім.(B) Мечаны радыеактыўнай пазнакай бялок візуалізуецца з дапамогай фосфарнай візуалізацыі.Палажэнне маркераў nsp12-His6 і малекулярнай масы бялку (у кіладальтонах) паказана ў A і B. (C) Інтэнсіўнасць радыеактыўнага сігналу (сярэдняе ± SEM) вызначалася з трох незалежных эксперыментаў.*P≤0,05.Сіла сігналу (у працэнтах) звязана з UTP.
Нягледзячы на тое, што звязаная з NiRAN актыўнасць ферментаў была паказана важнай для рэплікацыі EAV і SARS-CoV у культуры клетак (16), канкрэтная функцыя NiRAN і патэнцыйныя мішэні яшчэ не вызначаны.Нядаўна паведамілі аб структурным падабенстве паміж NiRAN і сямействам бялкоў з протеинкиназоподобными зморшчынамі (17, 22) заахвоціла нас праверыць гіпотэзу аб тым, што NiRAN каталізуе NMPylation іншых бялкоў.Мы стварылі набор патэнцыйных гамалагічных мішэняў, уключаючы неструктурныя вавёркі, кадаваныя HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), кожная з якіх утрымлівае C-канцавы тэг His6 (дадатак SI, табліца S1), і інкубаваць гэтыя вавёркі з [α32-P] урыдзінтрыфасфатам ([α32-P]UTP) у прысутнасці або адсутнасці nsp12.Сыроватачны альбумін буйной рагатай жывёлы і зліты бялок MBP-LacZα, выраблены ў кішачнай палачцы, служылі кантролем (малюнак 2А, дарожкі з 1 па 7).Бялок, пазначаны радыеактыўнай меткай, быў прааналізаваны з дапамогай электрафарэзу ў дадэцылсульфаце натрыю ў поліакрыламідным гелі (SDS-PAGE) і аўтарадыяграфіі, і было ўстаноўлена, што ў рэакцыі, якая змяшчае nsp12 і nsp9, быў моцны радыеактыўны сігнал.Становішча сігналу адпавядае малекулярнай масе nsp9, што паказвае на апасродкаванае nsp12 UMPylation nsp9 (малюнак 2B, трэк 7).Ніякіх іншых тэставых бялкоў не было выяўлена, каб быць UMPylated, што прывяло нас да высновы, што nsp9 з'яўляецца спецыфічным субстратам nsp12.У адпаведнасці з дадзенымі аб самапіляванні NMP, паказанымі на малюнку 1, nsp12 здольны перадаваць усе чатыры NMP на nsp9, хоць эфектыўнасць адрозніваецца: UMP> аденозинмонофосфат (AMP)> гуанозинмонофосфат (GMP)> цитидинмонофосфат (CMP)) ( Малюнак).3 А і Б).Ва ўмовах, якія выкарыстоўваюцца ў гэтым аналізе (скарачэнне часу рэакцыі і экспазіцыі, зніжэнне канцэнтрацыі nsp12; матэрыялы і метады), самастойнае NMP-піляванне nsp12 не можа быць выяўлена (параўнайце малюнак 2B, паласа 7 і малюнак 1B), што апынуўся эфектыўным (і некалькі раундаў) UMP перайшоў з nsp12 на nsp9.Актыўнасць UMP-трансферазы патрабуе прысутнасці іёнаў Mn2+, як паказана на малюнку 3C, у той час як у прысутнасці Mg2+ назіралася толькі мінімальная актыўнасць UMP-трансферазы, і ніякай актыўнасці ў прысутнасці двух іншых двухвалентных катыёнаў.Аналагічныя дадзеныя былі атрыманы ў аналізах NMPylation, якія змяшчаюць цытыдынтрыфасфат (CTP), гуанозінтрыфасфат (GTP) і адэназінтрыфасфат (АТФ) (дадатак SI, малюнак S1).
HCoV-229E nsp12-апасродкаванае UMPiляванне nsp9.Шэраг бялковых субстратаў (уключаючы бычыны сыроватачны альбумін, MBP-lacZα і серыю HCoV-229E nssp, пазначаных C-канцавым His6, кадаваным ORF1a), выкарыстоўвалі для ацэнкі актыўнасці UMPylation HCoV-229E nsp12-His6⁺-апасродкаванай бялок.Інкубуйце бялок з [α-32P] UTP на працягу 10 хвілін у адсутнасць (A) або ў прысутнасці (B) nsp12, як апісана ў матэрыялах і метадах.Уверсе A і B паказаны SDS-поліакрыламідны гель, афарбаваны кумасі Brilliant Blue, а ўнізе A і B паказаны адпаведныя аўтарадыяграмы.Становішча маркера малекулярнай масы бялку (у кіладальтонах) прыведзена злева.Таксама пазначаны становішча nsp12-His6 (B, уверсе) і радыеактыўны сігнал, які назіраецца падчас інкубацыі nsp12-His6 з nsp9-His6 (B, дарожка 7), што паказвае на тое, што [α-32P]UMP да nsp9-His6 (12,9 кДа), чаго не назіралася для іншых пратэставаных бялкоў.
HCoV-229E NiRAN-апасродкаваная біяхімічная і вірусалагічная характарыстыка nsp9 NMPylation.(A і B) Роля нуклеатыднага косубстрата, які выкарыстоўваецца ў рэакцыі.Nsp12-His6 і nsp9-His6 змешваюць і інкубуюць у прысутнасці розных [α-32P] NTP у стандартным аналізе NMPylation.(A, уверсе) Афарбаваны кумасі nsp9-His6, падзелены SDS-PAGE.(A, унізе) Аўтарадыёграма той жа вобласці геля.(B) Адносная актыўнасць (сярэдняе ± SEM) у прысутнасці прызначанага нуклеатыднага кофактора вызначаецца з трох незалежных эксперыментаў.*P≤0,05.(C) Роля іёнаў металаў.Паказаны стандартны тэст NMPylation у прысутнасці [α-32P] UTP і розных іёнаў металаў, кожны з канцэнтрацыяй 1 мм.На C, уверсе, паказана афарбоўка Кумасі nsp9-His6, а на C, унізе, паказана адпаведная аўтарыяграфія.Памер пазначанага бялку (у кіладальтонах) паказаны злева ад A і C. (D) Мутантная форма HCoV-229E nsp12-His6, якая нясе ўказаную амінакіслотную замену, знаходзіцца ў [α-32P]UTP, як апісана у матэрыялах і метадах.Пазначаны радыеактыўнай меткай nsp9-His6, які ўтвараецца ў рэакцыі NMPylation, выяўляецца пры візуалізацыі фасфаралявання (D, уверсе).Адносная актыўнасць у параўнанні з бялком дзікага тыпу (па масе) паказана ў D, а ніжняя прымаецца за сярэдняе (±SEM) з трох незалежных эксперыментаў.Зорачкі паказваюць замены некансерватыўных астаткаў.(E) Тытр віруса ў супернатанте культуры клетак p1, атрыманых праз 24 гадзіны пасля заражэння, вызначалі аналізам налёту.Пазначаны замены кадонаў у дамене NiRAN сканструяванага мутанта HCoV-229E (нумарацыя астаткаў заснавана на іх становішчы ў pp1ab).У якасці кантролю выкарыстоўваўся мутант актыўнага сайта RdRp з дэфіцытам рэплікацыі nsp12_DD4823/4AA.
Каб атрымаць больш глыбокае разуменне актыўнага цэнтра NiRAN і вызначыць рэшткі, звязаныя з актыўнасцю nsp9-спецыфічнай NMP-трансферазы, мы правялі аналіз мутацый, у якім мы замянілі кансерватыўныя рэшткі ў матывах NiRAN AN, BN і CN ( 16) Гэта Ala (дадатак SI, малюнак S2).Акрамя таго, у двух выпадках быў ацэнены ўплыў кансерватыўных замен Arg-на-Lys або Lys-на-Arg.У якасці (адмоўнага) кантролю рэшткі, якія не захоўваюцца або менш захоўваюцца ў дамене NiRAN каранавірусаў і іншых укладзеных вірусаў, замяняюцца на Ala. Замена K4116A (у матыве preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (матыў BN) і D4280A (CN) значна зніжае або нават ліквідуе nsp9 NMPylation праз nsp12, у той час як вавёркі з кансерватыўнымі заменамі (R4178K), K4116R) захоўваюць 60% і 80% сваёй актыўнасці, што сведчыць аб тым, што паслабленне абмежаванняў з іх адпаведнага боку ланцугоў з'яўляецца фізіка-хімічна адчувальным (малюнак 3D).Замена некалькіх іншых кансерватыўных рэшткаў E4145A, D4273A, F4281A і D4283A значна менш шкодная, а UMPylation nsp9 зніжаецца толькі ўмерана.Падобныя вынікі былі атрыманы ў рэакцыях NMP-пілявання nsp9 з удзелам іншых NTP (малюнак 3D і дадатак SI, малюнак S3), што пацвярджае, што назіраныя эфекты на спецыфічныя замены амінакіслот не залежаць ад тыпу выкарыстоўванага нуклеатыднага субстрата.Далей мы праверылі магчымы ўплыў гэтых замен nsp12 на рэплікацыю каранавірусаў у культуры клетак.З гэтай мэтай мы выкарыстоўвалі адпаведныя генна-інжынерныя камплементарныя шаблоны ДНК (кДНК), кланаваныя ў рэкамбінантныя вірусы вакцыны (23, 24), каб транскрыбаваць 5 -7 клетак.Тытраванне нашчадкаў інфекцыйнага віруса, атрыманага ў гэтых клетках, паказала, што большасць мутантаў HCoV-229E NiRAN немагчымыя (малюнак 3E).Група нежыццяздольных вірусных мутантаў уключае альтэрнатывы, якія, як было паказана, ліквідуюць або значна зніжаюць актыўнасць трансферазы NMP in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), але ёсць дзве іншыя альтэрнатывы (K4116R, E4145A) 80 % зарэзервавана?Іх NMPylation актыўнасць in vitro сведчыць аб дадатковых абмежаваннях.Аналагічным чынам, дзве іншыя мутацыі (R4178K, F4281A), якія выклікалі ўмеранае зніжэнне актыўнасці NMPylation ў NiRAN in vitro, далі жывыя вірусы, аднак гэтыя вірусы значна знізілі тытры шляхам рэплікацыі.У адпаведнасці з дадзенымі аб актыўнасці in vitro, паказанымі на малюнку 3D, замена чатырох іншых рэшткаў, якія не захоўваюцца ў каранавірусе і/або іншых укладзеных вірусах (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16), дала жыццяздольныя вірусы. Нашчадства, нягледзячы на наяўнасць умерана паніжаны тытр у параўнанні з вірусам дзікага тыпу (малюнак 3E).
Каб вывучыць, ці залежыць NiRAN-апасродкаваная актыўнасць трансферазы NMP ад актыўнага дамена RdRp, два кансерватыўных астатку Asp, якія ўдзельнічаюць у каардынацыі іёнаў двухвалентнага металу (11) у матыве C RdRp, былі заменены на Ala. Атрыманы бялок nsp12_DD4823/4AA захоўвае яго актыўнасць nsp9 NMPylation, паказваючы, што nsp12-апасродкаваная актыўнасць nsp9 NMPylation in vitro не патрабуе актыўнасці палімеразы (SI Дадатак, малюнак S4).
Пасля ўстанаўлення nsp9-спецыфічнай актыўнасці NMP-трансферазы для nsp12 мы паспрабавалі ахарактарызаваць аддукт NMP-nsp9 з дапамогай мас-спектраметрыі (МС).Поўны мас-спектр бялку рэкамбінантнага HCoV-229E nsp9 паказаў пік пры 12 045 Да (малюнак 4A).Даданне nsp12 не змяніла якасць nsp9, што паказвае на тое, што nsp12 і nsp9 не ўтвораць стабільны комплекс у выкарыстоўваных умовах (дэнатурацыя) (малюнак 4A).У прысутнасці UTP і GTP вымярэнне масы рэакцыі, якая змяшчае nsp9 і nsp12 адпаведна, паказала, што маса бялку UTP перамясцілася на 306 Да, а маса бялку GTP перамясцілася на 345 Да, што сведчыць аб тым, што кожная малекула nsp9 звязвае UMP або GMP (Малюнак 4) C і D).Мяркуецца, што энергія, неабходная для NiRAN-апасродкаванага nsp9 NMPylation, паходзіць ад гідролізу NTP і вызвалення пірафасфату.Хоць у гэтай рэакцыі быў выкарыстаны 10-кратны малярны лішак nsp9 (мішэнь), чым nsp12 (фермент), назіралася амаль поўнае NMP-пілаванне nsp9, што паказвае на тое, што ўзаемадзеянне паміж nsp12 і nsp9 кароткачасовае, і nsp12 можа NMP-пілаваць больш nsp9 in vitro малекула.
Адно NMP-піляванне nsp9 у прысутнасці nsp12 і UTP або GTP.Паказаны дэканволюцыйны поўны масавы спектр бялку HCoV-229E nsp9 (дадатак SI, табліца S1) (AD).(A) толькі nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 у прысутнасці UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 у прысутнасці GTP.
Для вызначэння рэшткаў nsp9 UMP, пілаваных nsp12, nsp9-UMP расшчапляюць трыпсінаў.Атрыманыя пептыды былі падзелены з дапамогай нана-высокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі (ВЭЖХ) і прааналізаваны з дапамогай тандэмнай мас-спектраметрыі (MS/MS) онлайн.Аналіз дадзеных з выкарыстаннем праграмнага пакета Byonic (Protein Metrics) паказаў UMPylation N-канцавой амінакіслоты.Гэта пацвярджаецца ўручную.Тандэмны мас-спектр пептыда-папярэдніка [UMP]NNEIMPGK (дадатак SI, малюнак S5A) выявіў фрагмент пры 421 m/z, які паказвае, што UMP звязваецца з астаткам 1 nsp9.
На N-канцы nsp9 Asn захоўваецца сярод членаў Orthocoronavirinae (дадатак SI, малюнак S6).Хоць мы лічым, што N-канцавы азот першаснага аміну з'яўляецца найбольш верагодным акцэптарам для UMP, мы вырашылі атрымаць дадатковыя доказы звязвання NMP на N-канцы.Па гэтай прычыне N-канцавы пептыд nsp9 без NMP і NMP-піліраваны, ачышчаны з дапамогай ВЭЖХ, быў атрыманы ў прысутнасці ацэтону і цианборгидрида натрыю.У гэтых умовах толькі свабодныя першасныя аміны могуць быць мадыфікаваны прапілам (25).N-канцавы пептыд, атрыманы з nsp9, з паслядоўнасцю NNEIMPGK змяшчае два першасных аміна, адзін на N-канцы Asn, а другі - на бакавой ланцугу Lys на С-канцы.Такім чынам, прапільныя групы могуць быць уведзены на абодвух канцах.Вынятыя іённыя храматаграмы не-NMPylated пептыдаў паказаны ў дадатку SI, малюнак S5B.Як і чакалася, можна ідэнтыфікаваць (мона)прапілаваныя (дадатак SI, малюнак S5B, верхняя паласа) і дыпрапілаваныя пептыды (дадатак SI, малюнак S5B, ніжняя паласа) N-канцавы і C-канцавы.Гэтая мадэль змяняецца з выкарыстаннем N-канцавога пептыда nsp9, пілаванага NMP.У гэтым выпадку могуць быць ідэнтыфікаваны толькі C-канцавыя пропилированные пептыды, але N-канцавыя пропилированные пептыды і дипропилированные пептыды не ідэнтыфікуюцца (Дадатак SI, малюнак S5C), што паказвае на тое, што UMP быў перанесены ў N-канцавы першасны амін, каб прадухіліць гэта група ад унясення змяненняў.
Затым мы замяняем (з Ala або Ser) або выдаляем кансерватыўныя рэшткі на N-канцы nsp9, каб вызначыць абмежаванні, характэрныя для мэты.Грунтуючыся на нашых дадзеных MS, якія паказваюць, што NiRAN утварае аддукт nsp9-NMP з першасным амінам N-канцавога астатку nsp9, мы выказалі здагадку, што NMP-піляцыя nsp9 патрабуе віруснай галоўнай пратэазы (Mpro, nsp5), каб вызваліць N-канцавы nsp9 з яго полипротеиновый папярэднік.Каб праверыць гэтую гіпотэзу, мы вырабілі бялок-папярэднік nsp7-11, які змяшчае nsp9, у кішачнай палачцы і правялі стандартны тэст NMPylation ў прысутнасці [α-32P] UTP (матэрыялы і метады).Як паказана на малюнку 5A (дарожка 3), неразрэзаны папярэднік nsp7-11 не пазначаны радыеактыўнай меткай nsp12.У адрозненне ад гэтага, калі nsp7-11 расшчапляецца рэкамбінантным nsp5 для вызвалення nsp9 (і іншых nssp) ад папярэдніка, выяўляецца бялок, пазначаны радыеактыўнай пазнакай, які мігруе з nsp9, што пацвярджае нашу выснову, што NiRAN і N-селектыўнае адукацыю кавалентных аддуктаў nsp9-NMP .Канцавы першасны амін N-канцавога Asn (пазіцыя 3825 у pp1a/pp1ab).Гэтая выснова таксама пацвярджаецца эксперыментамі з выкарыстаннем канструкцыі nsp9, якая змяшчае адзін ці два дадатковых астатку на N-канцы.У абодвух выпадках апасродкаванае NiRAN UMPylation nsp9 было адменена (Дадатак SI, малюнак S7).Затым мы вырабілі бялок з адным або двума рэшткамі Asn, выдаленымі з паслядоўнасці пептыда 3825-NNEIMPK-3832 на N-канцы nsp9.У абодвух выпадках nsp9 UMPylation быў цалкам заблакаваны (малюнак 5B), забяспечваючы дадатковыя доказы таго, што рэальны nsp9 N-канец дзейнічае як рэцэптар NMP.
Пратэялітычных апрацоўкі nsp9 і ролю N-канцавых рэшткаў у nsp12-апасродкаванай UMPylation.(A) nsp9 UMPylation патрабуе вольнага N-тэрмінала nsp9.Nsp7-11-His6 папярэдне інкубуюць пры 30 °C у буферы для выяўлення NMPylation, які змяшчае UTP у прысутнасці або адсутнасці рэкамбінантнага Mpro (nsp5-His6).Праз 3 гадзіны пачніце аналіз NMPylation, дадаўшы nsp12-His6, як апісана ў раздзеле "Матэрыялы і метады".Рэакцыя, якая змяшчае nsp5-His6 (дарожка 1) і nsp9-His6 (дарожка 2), выкарыстоўвалася ў якасці кантролю.Праз 10 хвілін рэакцыю спыняюць і рэакцыйную сумесь раздзяляюць з дапамогай SDS-PAGE.Бялок быў афарбаваны кумасі Brilliant Blue (A, зверху).Папярэднік Nsp7-11-His6 і апрацаваны прадукт у выніку апасродкаванага расшчаплення nsp5-His6 паказаны справа.Звярніце ўвагу (з-за іх невялікага памеру), што nsp7 і nsp11-His6 не выяўляюцца ў гэтым гелі, і рэакцыя дапаўняецца nsp5-His6 (дарожкі 1 і 4; становішча nsp5-His6 пазначана суцэльным кружком) або nsp9-His6 (дарожка 2) утрымлівае невялікую колькасць MBP (пазначаны пустымі кружкамі) у выглядзе рэшткавых прымешак, таму што яны выяўляюцца ў выглядзе злітых бялкоў MBP (дадатак SI, табліца S1).(B) Варыянт Nsp9-His6 не мае аднаго або двух N-канцавых рэшткаў Asn (нумарацыя астаткаў у адпаведнасці з пазіцыяй у pp1a/pp1ab), яго чысцяць і інкубуюць з nsp12-His6 і [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE, афарбаваны кумасси, паказаны ўверсе, B, адпаведная аўтарадыёграма паказана ўнізе.Становішча маркера малекулярнай масы (у кіладальтонах) паказана злева.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-канцавых кансерватыўныя рэшткі былі заменены на Ala або Ser, і такое ж колькасць бялку было выкарыстана ў nsp12-His6 апасродкаванай рэакцыі UMPylation.Прадукты рэакцыі падзялялі з дапамогай SDS-PAGE і афарбоўвалі кумасі брыльянтавым сінім (C, уверсе), а пазначаны радыеактыўнай меткай nsp9-His6 выяўлялі з дапамогай фасфарасцэнтнай візуалізацыі (C, пасярэдзіне).Выкарыстоўваючы бялок дзікага тыпу (маса) у якасці эталона (усталяваны на 100%), адносная актыўнасць NMPylation (сярэдняе ± SEM) была разлічана з трох незалежных эксперыментаў.(D) Тытры віруса ў супернатанте культуры клетак p1 клетак Huh-7, інфіцыраваных клеткамі Huh-7 дзікага тыпу HCoV-229E, і мутантаў, якія нясуць прызначаныя амінакіслотныя замены ў nsp9, вызначалі з дапамогай аналізу налёту.Дэфіцыт рэплікацыі RdRp матыў C двайны мутант DD4823/4AA быў выкарыстаны ў якасці адмоўнага кантролю.
N-канец nsp9 (асабліва пазіцыі 1, 2, 3 і 6) вельмі кансерватыўны сярод членаў падсямейства Orthocoronavirinae (дадатак SI, малюнак S6).Для таго, каб вывучыць магчымую ролю гэтых астаткаў у nsp12-апасродкаванай nsp9 NMPylation, два паслядоўных Asn рэшткаў на N-канцы nsp9 былі заменены на Ala або Ser (асобна або ў камбінацыі).У параўнанні з дзікім тыпам nsp9, замена N3825 на Ala або Ser прывяла да больш чым двухразовага зніжэння nsp12-апасродкаванай UMPylation (малюнак 5C).У адпаведнасці з нашым высновай аб тым, што NMPylation адбываецца на N-канцавым першасным аміне замест бакавой ланцуга N-канцавога астатку, мы назіралі значнае рэшткавае NMPylation з заменай N3825A і N3825S.Цікава, што калі другі Asn замяняецца на Ala або Ser, UMPylation nsp9 зніжаецца мацней (больш чым у 10 разоў), у той час як замена Ala ў пазіцыях 3, 4 і 6 мае толькі ўмераны ўплыў на UMPylation nsp9 (малюнак 2). ) .5C).Падобныя вынікі былі атрыманы пры выкарыстанні ATP, CTP або GTP (дадатак SI, малюнак S8).У сукупнасці гэтыя дадзеныя паказваюць на ключавую ролю N2826 (пазіцыя 2 у nsp9) у nsp9 NMPylation.
Каб атрымаць дадатковыя доказы функцыянальнай карэляцыі паміж N-канцом nsp9 і NMPylation, мы правялі множнае выраўноўванне паслядоўнасцей (MSA) паслядоўнасці nsp9 сямейства Coronavirus (вар'іруецца ад 104 да 113 астаткаў) (Дадатак SI, малюнак S6).У агульнай складанасці ў 47 (вядомых і меркаваных) відаў з 5 родаў падсямейства Orthocoronavirinae, якія заражаюць розных млекакормячых, птушак і рэптылій-гаспадароў, толькі 8 астаткаў аказаліся нязменнымі.Найбольш шырокія змены, уключаючы дэлецыі і ўстаўкі, назіраліся ў цыклах паміж элементамі другаснай структуры nsp9, як было вызначана папярэднімі структурнымі даследаваннямі (26-28).Пяць нязменных астаткаў былі знойдзены ў β-ланцугу і α-спіралі C-канцавой часткі nsp9.Тры інварыянтных астатку складаюць матыў NNE N-канца nsp9.Выяўлена, што другі Asn гэтага матыву з'яўляецца адзіным нязменным астаткам, які таксама падзяляе гіпатэтычны nsp9 далёкага роднаснага каранавіруса жабы і ўяўляе сабой Microhyla letovirus 1 з падсямейства Letovirinae Alphaletovirus.Захаванне рэшткаў у элементах другаснай структуры nsp9 можа быць рацыяналізавана структурнымі меркаваннямі, каб захаваць згортванне або вядомыя ўласцівасці звязвання РНК.Аднак гэтыя развагі, здаецца, не прымяняюцца да захавання NNE, і да гэтага даследавання прырода абмежаванняў, якія абмяжоўваюць варыяцыі трыпептыднай паслядоўнасці, была цалкам зацемнена.
Для таго, каб вызначыць важнасць nsp9-NMPylation і NNE кансервацыі ў рэплікацыі каранавіруса, мы вырабілі HCoV-229E мутанты, якія нясуць адзінкавыя або падвойныя замены nsp9 N-канцавых астаткаў, што сведчыць аб тым, што nsp9 NMPylation з'яўляецца шкодным in vitro.Перш чым мы пачнем, мы паспрабуем адказаць на пытанне, ці ўплываюць гэтыя замены (каля сайта расшчаплення nsp8|9) на пратэялітычны працэсінг C-канцавой вобласці pp1a.Набор поліпратэінавых канструкцый nsp7-11, якія змяшчаюць адпаведныя замены на N-канцы nsp9, былі атрыманы ў E. coli і разрэзаны рэкамбінантнымі Mpro.На пратэялітычнае расшчапленне чатырох сайтаў (уключаючы фланкуючы сайт nsp9) істотна не ўплываюць ніякія ўведзеныя замены (дадатак SI, малюнак S9), за выключэннем структурных змяненняў у гэтых бялках, якія перашкаджаюць апасродкаванаму Mpro расшчапленню nsp8|9 (ці іншае) сайт.
Клеткі Huh-7 трансфікавалі РНК HCoV-229E даўжынёй геному, якая кадуе замены Ala або Ser у кансерватыўных трыпептыдах NNE (N3825, N3826 і E3827) на N-канцы nsp9, што паказвае, што большасць мутацый смяротныя.Мы змаглі выратаваць вірус, замяніўшы Ser або Ala N-канцавога Asn (N2835A або N2835S), але не змаглі аднавіць вірус з іншымі адзінарнымі і падвойнымі мутацыямі ў паслядоўнасці NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (малюнак 5D).
Гэтыя вынікі паказваюць, што рэплікацыя каранавірусаў у культуры тканін абмежавана (аднолькавая або падобная), што абмяжоўвае натуральную мутацыю сайтаў NMP-пілявання nsp9 у арганізме і пацвярджае ключавую ролю гэтага адказу ў жыццёвым цыкле каранавірусаў.
У апошнім наборы эксперыментаў мы стварылі C-канцавы His6, пазначаны SARS-CoV-2 nsp12 і nsp9, і дзве мутантныя формы nsp12 у E. coli.Рэшткі актыўнага сайта ў даменах NiRAN і RdRp былі адпаведна замест гэтага выкарыстоўвайце Ala (малюнак 6A і дадатак SI, табліца S2).K4465 у SARS-CoV-2 nsp12 адпавядае K4135 у HCoV-229E (Дадатак SI, малюнак S2), які аказаўся неабходным для актыўнасці NiRAN і рэплікацыі HCoV-229E (малюнак 3D і E).Гэты астатак таксама адпавядае астатку артэрыяльнага віруса EAV nsp9 K94, які раней быў паказаны неабходным для NiRAN само-UMPylation/само-GMPylation (16).Як паказана на малюнку 6B, SARS-CoV-2 nsp12 валодае актыўнасцю трансферазы UMP з выкарыстаннем nsp9 у якасці субстрата, у той час як мутант актыўнага сайта nsp12_K4465A неактыўны.Двайная замена ў характэрнай паслядоўнасці SDD матыву C RdRp не ўплывае на актыўнасць трансферазы UMP (малюнак 6B), што паказвае на тое, што актыўнасць RdRp не аказвае прамога ўплыву на UMPylation nsp9.Падобныя дадзеныя былі атрыманы з выкарыстаннем CTP, GTP і ATP (дадатак SI, малюнак S10).Такім чынам, гэтыя дадзеныя паказваюць, што апасродкаванае NiRAN nsp9 NMPylation мае кансерватыўную актыўнасць у каранавірусах, якія прадстаўляюць розныя роды падсямейства ортокоронавирусов.
NMP-піляцыя nsp9, апасродкаваная SARS-CoV-2 nsp12.(A) Афарбаваны кумасі поліакрыламідны гель SDS, які паказвае рэкамбінантны бялок, які выкарыстоўваецца ў тэсце NMPylation.У якасці кантролю выкарыстоўваўся мутантный бялок з заменай актыўнага цэнтра ў дамене NiRAN (K4465A) і дамене RdRp (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12.Нумарацыя астаткаў заснавана на пазіцыі ў pp1ab.(B) Аўтарадыёграма выяўлення UMPylation з выкарыстаннем nsp9-His6 і [α-32P] UTP у якасці субстрата nsp12-His6 (дзікага тыпу [маса] і мутанта).Малекулярная маса (у кіладальтонах) пазначанага бялку паказана злева.
Дамены NiRAN звычайна захоўваюцца ў Nidovirales (16), што паказвае на тое, што яны каталізуюць ферментатыўныя рэакцыі, неабходныя для рэплікацыі Nidovirus.У гэтым даследаванні мы змаглі даказаць, што дамен NiRAN каранавіруса пераносіць NMP (генераваны з NTP) у nsp9, таямнічы бялок, які звязвае РНК, які ўдзельнічае ў рэплікацыі віруса (26?? 29), каб вызначыць яго як натуральную мішэнь і партнёр каранавіруснага RTC.
Дамен NiRAN падзяляе тры матывы паслядоўнасці (AN, BN і CN), якія ўтрымліваюць вельмі невялікую колькасць рэшткаў, захаваных ва ўсіх сем'ях монофилетического, але высокадыферэнцыраванага парадку Nidovirales (8, 16).Нядаўнія даследаванні паказалі, што яны структурна звязаны з у значнай ступені неахарактарызаваным сямействам протеинкиназоподобных бялкоў, якія першапачаткова называліся сямействам SelO (17, 19, 22, 30, 31).Вавёркі, звязаныя з SelO, маюць кіназныя зморшчыны, але не маюць некалькіх кансерватыўных рэшткаў актыўнага цэнтра ў класічных кіназах (22, 32).Грунтуючыся на адваротнай арыентацыі малекул АТФ, звязаных з актыўным цэнтрам і стабілізаваных спецыфічнымі ўзаемадзеяннямі, была выказана гіпотэза, якая пазней пацвердзілася, што SelO пераносіць АМФ (замест фасфату) на бялковы субстрат (22), у той час як іншы бактэрыяльны SelO-падобны бялок YdiU мае Нядаўна было паказана, што ён каталізуе кавалентнае прымацаванне UMP да Tyr і His рэшткаў розных бялковых субстратаў (33).
Для пацверджання і пашырэння прагнозу меркаваных рэшткаў актыўнага сайта каранавіруснага дамена NiRAN мы выкарысталі біяхімічныя метады і метады зваротнай генетыкі для правядзення аналізу мутацый каранавіруса nsp12 (малюнак 3D і дадатак E і SI, малюнак S3 і табліца) S1â S4).Дадзеныя паказваюць, што замена HCoV-229E K4135, R4178 і D4280 на Ala ліквідуе in vitro актыўнасць NMP трансферазы і рэплікацыю віруса ў культуры клетак (малюнак 3D і дадаткі E і SI, малюнак S3), пацвярджаючы іх прысутнасць у NTP γ-фасфаце (K4135, R4178) і каардынацыі іёнаў металаў актыўнага цэнтра (D4280).Было паказана, што замена E4145A кансерватыўнага Glu у дыяпазоне віруса птушынага гнязда, які, па прагнозах, стабілізуе становішча K4135 (17), ліквідуе рэплікацыю віруса, але, як ні дзіўна, актыўнасць захавалася ў аналізе NMPylation in vitro (малюнак 3D і E і Дадатак SI, малюнак S3 і табліцы S1–S4).Падобнае назіранне было зроблена, калі адпаведная замена была ўведзена ў гамолаг YdiU Salmonella typhimurium (E130A) (33).У сукупнасці гэтыя дадзеныя пацвярджаюць рэгулятарную функцыю гэтага захаванага астатку, а не каталітычную функцыю.
Замена кансерватыўнага астатку Phe (F4281A) у дыяпазоне неставіруса ў дамене HCoV-229E NiRAN (8) прывяла да зніжэння актыўнасці NMPylation in vitro і значнага зніжэння рэплікацыі віруса ў культуры клетак (малюнак 3D, E і SI) дадатак, малюнак S3).Дадзеныя адпавядаюць важнай рэгулятарнай функцыі гэтага астатку, напрыклад, гамалагічнага астатку Phe матыву DFG, паказанага раней.У класічных протеинкиназах ён з'яўляецца часткай пятлі звязвання Mg2+ і дапамагае збіраць і рэгуляваць хрыбетнік???Неабходны для эфектыўнай каталітычнай актыўнасці (32, 34).Замена Ala і Arg на рэшткі K4116 (у матыве preAN), адпаведна, ліквідавала рэплікацыю віруса і, як і чакалася, мела розныя эфекты на актыўнасць трансферазы NMP in vitro ў залежнасці ад уведзенага бакавога ланцуга амінакіслоты (малюнак 3D і дадаткі E і SI , малюнак S3).Функцыянальныя дадзеныя супадаюць са структурнай інфармацыяй, паказваючы, што гэты астатак усталяваў ўзаемадзеянне з АТФ-фасфатам (17).У дамене NiRAN іншых сямействаў укладзеных вірусаў пазіцыя HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 займае Lys, Arg або His (8), што паказвае на тое, што функцыянальнае абмежаванне гэтага спецыфічнага астатку было аслаблена.Замена D4188A і D4283A ліквідуе або моцна зніжае актыўнасць фермента і ліквідуе рэплікацыю віруса (малюнак 3).Гэтыя два рэшткі захоўваюцца ў большасці (але не ва ўсіх) укладзеных вірусаў (8), што сведчыць аб важнай спецыфічнай для сямейства, але, магчыма, некаталітычнай функцыі.Ala замены некалькіх іншых астаткаў Lys і Asp (K4113A, D4180A, D4197A і D4273A), якія не захаваліся ў Coronaviridae або іншых сямействах Nestioviridae (8), выкарыстоўваліся ў якасці кантролю.Як і чакалася, гэтыя замены ў значнай ступені прымальныя, у некаторых выпадках з невялікім зніжэннем актыўнасці ферментаў і рэплікацыі віруса (малюнак 3 і дадатак SI, малюнак S3).У цэлым, дадзеныя па мутагенезу каранавірусу вельмі адпавядаюць дадзеным GMP і зваротнай генетыкі EAV NiRAN-RdRp (16), у якіх EAV nsp9 (артолаг каранавіруса nsp12) астатак K94 (адпаведны HCoV- 229E K4135) выконвае важныя функцыі), R124 (адпаведны R4178), D132 (адпаведны D4188), D165 (адпаведны D4280), F166 (адпаведны F4281).Акрамя таго, дадзеныя па мутагенезу HCoV-229E супадаюць з дадзенымі зваротнай генетыкі SARS-CoV (16) і пашыраны на іх (16), вельмі падобныя на тыя, якія назіраюцца для адпаведнага матыву CN Phe-to-Ala, мутанта SARS-CoV_nsp12. апісаны фенатып -F219A і HCoV-229E_F4281A (малюнак 3 D і E і дадатак SI, малюнак S3 і табліца S1-S4).
У параўнан перададзены ўсе чатыры NMP, хоць ёсць невялікая перавага для UMP (малюнкі 1 і 3).Адносна нізкая спецыфічнасць спецыфічнага косубстрата NTP супадае з нядаўна паведамленай суперкампазітнай структурай SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, у якой ADP-Mg2+ звязваецца з актыўным цэнтрам NiRAN, але не з аденінавай часткай фарміравання спецыфічных узаемадзеянняў (17).У нашым даследаванні тып нуклеатыдаў, які выкарыстоўваецца ў рэакцыі NMPylation, не мае дыферэнцыяльнага ўплыву на актыўнасць мутантнага бялку (Дадатак SI, малюнак S3), што паказвае на тое, што ні адзін з гэтых астаткаў не мае цеснай сувязі са звязваннем пэўнага нуклеінавага падставы.Структурныя асновы і патэнцыйнае біялагічнае значэнне розных пераваг сусубстратаў NTP, якія назіраюцца ў даменах NiRAN каранавірусаў і артэрыяльных вірусаў, яшчэ трэба вывучыць;яны могуць быць праўдай або быць з-за абмежаванняў іх адпаведных даследаванняў.У цяперашні час нельга выключаць, што патэнцыйная актыўнасць NMPylator у дамене NiRAN артэрыяльнага віруса (у параўнанні з раней ахарактарызаванай актыўнасцю самапілявання NMP) мае розныя перавагі ў субстраце, прымаючы пад увагу, што падабенства паміж артэрыяльным вірусам і каранавірусам Дамен NiRAN дасягнуў мяжы.Параўнанне на аснове паслядоўнасці (16).У параўнанні з псеўдакіназай SelO, якая выкарыстоўвае Mg2+ у якасці кафактару, актыўнасць каранавіруса і артэрыяльнага віруса NiRAN залежыць ад Mn2+ (16) (малюнак 3C і дадатак SI, малюнак S1).Залежнасць ад Mn2+ і відавочная перавага UTP з'яўляюцца незвычайнай асаблівасцю бялковых NMPylators і толькі нядаўна былі пацверджаны ў бялку YdiU Salmonella typhimurium, які каталізуе строгае Mn2+-залежнае шапероннае UMPylation бялку для абароны клетак ад індукцыі стрэсу Пул клеткавага АТФ ( 33).
Нядаўна апісанае структурнае падабенства паміж даменам NiRAN каранавіруса і клеткавымі пратэінкіназамі (17, 19) забяспечвае дадатковую падтрымку здольнасці NiRAN кавалентна звязваць NMP з іншымі вавёркамі, пра якія мы паведамлялі ў гэтым даследаванні.Мы сканцэнтравалі наш пошук магчымых мішэняў NiRAN на вавёрках, кадаваных HCoV-229E ORF1a, якія, як вядома, прама ці ўскосна дапамагаюць ORF1b-кадаванай рэпліказе RTC (12, 35).Нашы эксперыменты даюць пераканаўчыя доказы эфектыўнага і спецыфічнага NMPylation nsp9 (малюнак 2).Калі мэтавы бялок выкарыстоўваецца ў малярным лішку, які ў 8-10 разоў перавышае малярны лішак фермента (nsp12), пацвярджаецца, што nsp9 цалкам (мона)NMPized (малюнак 4).Мы прыйшлі да высновы, што ўзаемадзеянне паміж nsp12 і nsp9 кароткачасовае і не будзе ўтвараць стабільны комплекс з nsp9 (пры адсутнасці іншых субадзінак RTC).Гэтая выснова пацвярджаецца даследаваннямі ўзаемадзеяння бялкоў пратэома SARS-CoV (35).Аналіз MS вызначыў першасны амін N-канцавога астатку nsp9 як сайт NMPylation (SI дадатак, малюнак S5).Адукацыя фасфарамідатнай сувязі і N-канцавой амінагрупы адрознівае NiRAN-апасродкаваную актыўнасць NMPylation ад Pseudomonas syringae SelO-апасродкаванай рэакцыі AMPylation, якая каталізуе адукацыю O-звязанага AMP у Ser, Thr або Tyr рэштках Пептыдны аддукт ( 22), і S. typhimurium YdiU ўтварае O-злучаныя (з Tyr) і N-звязаныя (з His) аддукты пептыд-UMP.Абмежаваная інфармацыя, даступная аб сямействе бялкоў SelO, паказвае на тое, што члены гэтага вялікага сямейства бялкоў моцна адрозніваюцца па адукацыі аддуктаў пептыд-NMP.Гэта цікавае назіранне, якое заслугоўвае далейшага вывучэння.
Дадзеныя, атрыманыя ў гэтым даследаванні, прымусілі нас выказаць здагадку, што NMP-пілаванне nsp9 патрабуе свабоднага N-канца.У кантэксце рэплікацыі віруса гэта будзе забяспечвацца пратэялітычным расшчапленнем сайта працэсінгу nsp8|nsp9 у поліпратэіне рэпліказы pp1a, апасродкаваным Mpro і pp1ab.У большасці каранавірусаў розніца паміж гэтым спецыфічным месцам (VKLQ|NNEI ў HCoV-229E) і ўсімі іншымі месцамі расшчаплення Mpro каранавіруса заключаецца ў тым, што Asn (а не іншы невялікі астатак, напрыклад Ala, Ser або Gly) займае P1â???Месца (36).Дадзеныя аб расшчапленні пептыдаў, атрыманыя ў ранніх даследаваннях, паказалі, што эфектыўнасць расшчаплення сайта nsp8|nsp9 была ніжэй, чым у іншых сайтаў, што паказвае на тое, што 1) гэты спецыфічны сайт можа выконваць рэгулятарную ролю ў своечасовай скаардынаванай апрацоўцы С-канца pp1a вобласць, або 2) Роля спецыяльнага кансерватыўнага N-канца nsp9 у рэплікацыі віруса (37).Нашы дадзеныя (малюнак 5А) паказалі, што рэкамбінантныя форма nsp9, якая нясе рэальную N-канцавую паслядоўнасць, была эфектыўна NMPized nsp12.N-канцавая фланкіруючая паслядоўнасць была выдалена з дапамогай фактару Ха (nsp9-His6; дадатак SI, табліца S1) або Mpro-апасродкаванага расшчаплення (nsp7-11-His6; малюнак 5A і дадатак SI, табліца S1).Важна адзначыць, што папярэднік nsp7-11-His6, які змяшчае nsp9, паказаў устойлівасць да NMP-пілявання nsp12, што супадае з нашымі дадзенымі, паказваючы, што аддукт nsp9-NMP утвараецца праз N-канцавы першасны амін (дадатак SI, малюнак S5) .Каб атрымаць больш глыбокае разуменне спецыфічнасці субстрата NiRAN, мы засяродзіліся на прылеглых N-канцавых рэштках nsp9.Пры адсутнасці іншых бялкоў яны з'яўляюцца структурна гнуткімі, што прадухіляе іх выяўленне ў немаркіраванай форме nsp9 (26, 28, 38), што сведчыць аб іх абмежаванай натуральнай варыяцыі. Гэта звязана з важнай спецыфічнай паслядоўнасцю (не звязанай з другаснай структурай) функцыя N-канцавога фрагмента nsp9.Замены кансерватыўных астаткаў Ala ў гэтай вобласці (малюнкі 5C і D і дадатак SI, малюнак S8) паказваюць, што N3826 неабходны для NMP-пілявання nsp9 in vitro, у той час як замены N3825A і E3827A прыводзяць да зніжэння NMP-пілявання, у той час як замены M3829A і P3830A гэтага не робяць. .Відавочна ўплывае на NMPylation nsp9.Хоць замена N-канцавога Asn (N3825A, N3825S) аказвае толькі ўмераны ўплыў на NMP-піляцыю nsp9 і рэплікацыю віруса ў культуры клетак (малюнак 5C і D), выдаленне паслядоўнасці астатку Asn з N-канцавога дыпептыда 3825-NN аказалася, што ён смяротны для вірусаў, што паказвае на тое, што патрабуецца адзін рэшту Asn перад іншым рэшткам на N-канцы, пераважна Asn, хоць здаецца, што замена падобных рэшткаў можа быць часткова дапушчальная (малюнак 5B, C і D).Мы прыходзім да высновы, што дыпептыд 3825-NN, асабліва кансерватыўны і неабходны астатак N3826 у дыяпазоне каранавіруса (дадатак SI, малюнак S6), забяспечвае правільнае звязванне і арыентацыю N-канца nsp9 у актыўным цэнтры NiRAN.
Замена Ala (E3827A) на кансерватыўны Glu усіх падсямействаў захоўвае NMP-пілаванне nsp9 in vitro, але смяротна для вірусаў у культуры клетак (малюнак 5C і D), што паказвае на дадатковую функцыю гэтага астатку, напрыклад, у ключавых узаемадзеяннях (NMP-піляваны або немадыфікаваны ) nsp9 N-канец і іншыя фактары, якія ўдзельнічаюць у рэплікацыі віруса.Мутацыі Nsp9 не ўплываюць на пратэялітычны працэс nsp9 або любога суседняга nssp (39) (Дадатак SI, малюнак S9), што сведчыць аб тым, што смяротныя фенатыпы некалькіх назіраных мутацый nsp9 не былі выкліканыя парушэннем рэгуляцыі канцавой вобласці pp1a пратэялітычнага працэсу C .
Прыведзеныя вышэй дадзеныя сведчаць аб тым, што пасля Mpro-апасродкаванай апрацоўкі сайта расшчаплення nsp8|9 у pp1a/pp1ab N-канец nsp9 можа быць UMPylated (або часткова мадыфікаваны іншым NMP).Акрамя таго, выдатнае захаванне N-канца nsp9 (у тым ліку адзінкавых і нязменных рэшткаў Asn у сямействе коронавирусов) і дадзеныя зваротнай генетыкі, атрыманыя ў гэтым даследаванні (малюнкі 3E і 5D), прывялі нас да высновы, што апісаная NMP-піляцыя nsp9 біялагічна звязаны і неабходны для рэплікацыі каранавіруса.Функцыянальныя наступствы гэтай мадыфікацыі яшчэ трэба вывучыць, напрыклад, у дачыненні да апісанай раней (неспецыфічнай) актыўнасці звязвання РНК nsp9 (немадыфікаваная форма) (2628).N-канцавое NMPylation таксама можа ўплываць на ўзаемадзеянне nsp9 з бялковымі або РНК-субстратамі або на адукацыю розных чатырохузроўневых зборак.Гэта было заўважана ў структурных даследаваннях і было пацверджана, што яны функцыянальна звязаны з рэплікацыяй каранавіруса, хаця асабліва ў адсутнасць гэтай мадыфікацыі (26-ââ29, 40).
Нягледзячы на тое, што мэтавую спецыфічнасць каранавіруснага дамена NiRAN яшчэ трэба ахарактарызаваць больш падрабязна, нашы дадзеныя паказваюць, што спецыфічнасць бялку-мішэні каранавіруснага дамена NiRAN вельмі вузкая.Нягледзячы на тое, што захаванне ключавых рэшткаў актыўнага сайта (8, 16) у дамене NiRAN усіх сем'яў нідавірусаў моцна падтрымлівае актыўнасць кансерватыўнага NMPylator гэтых бялкоў, ідэнтычнасць субстрат-звязваючых кішэнных рэшткаў гэтага дамена Захаванне і кансервацыя яшчэ трэба ахарактарызаваць , і можа адрознівацца ў розных сем'ях Nidovirales.Сапраўды гэтак жа, адпаведныя мэты іншых укладзеных вірусаў яшчэ не вызначаны.Яны могуць быць аддаленымі арталагамі nsp9 або іншых бялкоў, таму што паслядоўнасці па-за межамі пяці даменаў рэпліказ, якія звычайна захоўваюцца ва ўкладзеных вірусах, менш кансерватыўныя (8), уключаючы масіў геному паміж Mpro і NiRAN. Сярод іх nsp9 знаходзіцца ў каранавірус.
Акрамя таго, у цяперашні час мы не можам выключыць магчымасць таго, што дамен NiRAN мае дадатковыя (у тым ліку сотавыя) мэты.У гэтым выпадку варта адзначыць, што бактэрыяльныя гамолагі ў гэтым новым бялку NMPylators (NMPylators) (30, 31), здаецца, маюць «галоўныя рэгулятары»?NMP мадулюе розныя клеткавыя вавёркі, каб рэгуляваць або ліквідаваць іх далейшую дзейнасць, тым самым гуляючы ролю ў розных біялагічных працэсах, такіх як клеткавая рэакцыя на стрэс і акісляльна-аднаўленчы гамеастаз (22, 33).
У гэтым даследаванні (малюнкі 2 і 4 і Дадатак SI, малюнкі S3 і S5) мы змаглі даказаць, што nsp12 перанёс частку UMP (NMP) у адно (захаванае) становішча ў nsp9, у той час як іншыя вавёркі не былі мадыфікаваны ў выкарыстоўваецца У гэтых умовах падтрымліваецца дакладна вызначаная (а не друзлая) спецыфічнасць субстрата.У адпаведнасці з гэтым, у параўнанні з N-канцавым NMP-піляваннем nsp9, уласная актыўнасць NMP-пілявання nsp12 вельмі нізкая, для яго выяўлення патрабуецца больш працяглы час аўтарыяграфічнага ўздзеяння, і выкарыстоўваецца 10-разовае павелічэнне канцэнтрацыі nsp12.Акрамя таго, наш аналіз MS не змог даць доказы NMPylation nsp12, што сведчыць аб тым, што NiRAN дамен самоNMPylation з'яўляецца (у лепшым выпадку) другаснай актыўнасцю.Аднак варта адзначыць, што іншыя даследаванні далі папярэднія доказы таго, што статус самоампилирования бактэрыяльнага NMPylator можа кантраляваць іх актыўнасць NMPylation на іншых бялковых субстратах (22, 33).Такім чынам, неабходныя дадатковыя даследаванні для вывучэння магчымых функцыянальных эфектаў актыўнасці самапілявання NMP, пра якія паведамляецца для EAV nsp9 (16) і каранавіруса nsp12 (гэта даследаванне), уключаючы прапанаваны шаперонападобны эфект на згортванне С-канцавога дамена RdRp ( 16)).
Раней было разгледжана некалькі гіпотэз адносна магчымых ніжэйстаячых функцый нідавіруснага дамена NiRAN, у тым ліку РНК-лігазы, РНК-капаванай гуанілаттрансферазы і праймінг-актыўнасці бялку (16), але ні адна з іх не сумяшчальная з даступнымі ніжэйстаячымі функцыямі.Інфармацыя, атрыманая ў наступных пазіцыях, дакладна супадае без дадатковых здагадак.Дадзеныя, атрыманыя ў гэтым даследаванні, найбольш адпавядаюць таму (але не могуць даказаць), што дамен NiRAN удзельнічае ў ініцыяцыі індукаванага бялком сінтэзу РНК.Раней лічылася, што функцыя дамена NiRAN у 5??Гэтыя і іншыя даныя не ўплываюць на рэакцыі кэпінгу ²-РНК або перавязкі РНК.Такім чынам, напрыклад, лічыцца, што актыўны сайт NiRAN уключае захаваны Asp у якасці агульнай асновы (D252 у Pseudomonas syringae SelO; D4271 у HCoV-229E pp1ab; D208 у SARS-CoV-2 nsp12) (Дадатак SI, малюнак 2 ).S2) (17, 22, 33), у той час як каталіз у АТФ-залежнай РНК-лігазе і РНК-закрываючым ферменте ажыццяўляецца кавалентным прамежкавым прадуктам фермента (лізіл-N)-NMP, які ўключае нязменены астатак Lys ( 41).Акрамя таго, выдатная заснаваная на паслядоўнасці спецыфічнасць каранавіруса NiRAN для кансерватыўных бялковых мішэняў і паслабленая спецыфічнасць для косубстратов NTP (аддае перавагу UTP) супрацьстаіць NiRAN-апасродкаванай функцыі кепінг-фермента або РНК-лігазы-падобных функцый.
Відавочна, што патрабуецца шмат дадатковай працы для праверкі і, калі гэта даказана, больш падрабязнай распрацоўкі магчымай ролі nsp9-UMP (nsp9-NMP) у індукаваным бялком сінтэзе РНК, што злучыць некалькі цікавых, але (пакуль) справаздач, апублікаваных раней .Адасобленыя назіранні.Напрыклад, было ўстаноўлена, што канец адмоўнай ланцуга РНК каранавіруса пачынаецца з аліга(U) ланцуга (42, 43).Гэта назіранне супадае з ідэяй, што сінтэз адмоўнай ланцуга РНК ініцыюецца шляхам звязвання UMPylated формы nsp9 з полі(А) хвастом (трыгеры), што можа спрыяць яго звязванне з РНК Актыўнасць і/або ўзаемадзеянне з іншы бялок RTC.Затым частка UMP, якую забяспечвае nsp9, можа быць выкарыстана ў якасці «праймера» для апасродкаванага nsp7/8/nsp12 алігаўрыдылявання з выкарыстаннем хваста 3??²-poly(A) у геномнай РНК або іншай паслядоўнасці, якая змяшчае аліга (A). служыць шаблонам, падобным механізму, усталяванаму для бялку VPg пикорнавируса (44).А калі прапанова «ненарматыўная»????Ініцыяцыя (індукаванага бялком) сінтэзу адмоўнай ланцуга РНК забяспечвае сувязь з назіраннямі, якія паказваюць, што РНК адмоўнага ланцуга каранавіруса мае UMP (замест UTP) на сваім канцы (42), што, як лічыцца, сведчыць аб тым, што нуклеінавая кіслата Dicer расшчапляе канец, фасфарыляваны невядомай урыдзін-спецыфічнай эндануклеазай.У выпадку пацверджання гэтая гідралітычная актыўнасць нуклеінавых кіслот можа дапамагчы вызваліць алігамерную UMPylated форму nsp9 з 5²-канца зараджаючагася адмоўнага ланцуга.Магчымая роля nsp9 у праймінг бялку таксама супадае з папярэднімі даследаваннямі зваротнай генетыкі, якія паказалі, што nsp9 (і nsp8) крытычна і спецыфічна ўзаемадзейнічаюць з кансерватыўным элементам цыс-дзейнай РНК каля 3-га канца геному каранавіруса.45).Згодна з гэтай справаздачай, гэтыя папярэднія назіранні цяпер могуць быць перагледжаны і пашыраны шляхам далейшых даследаванняў.
Такім чынам, нашы дадзеныя вызначаюць спецыфічную актыўнасць запатэнтаванага ўкладзенага віруснага фермента, звязанага з RdRp на N-канцы.У каранавірусе гэтая нядаўна выяўленая NiRAN-апасродкаваная актыўнасць UMPylator/NMPylator выкарыстоўваецца для залежнасці ад Mn2+ і прылеглых рэшткаў Asn і выклікае ўтварэнне (нізкаэнергетычных) фасфарамідатных сувязяў з N-канцавым першасным амінам.Дзякуючы Mpro-апасродкаванаму расшчапленню ў месцы расшчаплення nsp8|9, мішэнь nsp9 можа быць выкарыстана для NMPylation, што сведчыць аб функцыянальнай сувязі паміж пратэазай і даменам NiRAN, які распаўсюджваецца на RdRp.Захаванне ключавых рэшткаў у актыўным цэнтры NiRAN nsp12 і мішэні nsp9 у спалучэнні з дадзенымі, атрыманымі ад двух каранавірусаў, уключаючы SARS-CoV-2, дае важкія доказы таго, што NMPylation nsp9 з'яўляецца каранавірусам. Кансерватыўныя асаблівасці таксама з'яўляюцца ключавым этапам рэплікацыі віруса.Наяўныя дадзеныя дазваляюць зрабіць выснову, што канкрэтная роля NMPylated формы nsp9 у сінтэзе РНК, індукаваным бялком, з'яўляецца разумным сцэнарыем для каранавіруса і іншых укладзеных вірусаў, і NiRAN можа таксама нацэльвацца на іншыя неідэнтыфікаваныя вавёркі.Рэгуляваць вірус.Узаемадзеянне з гаспадаром.У выпадку пацверджання ўдзел бялковых праймераў у сінтэзе віруснай РНК павялічыць сродства паслядоўнасці даменаў Mpro/3CLpro і RdRp паміж раней выяўленымі коронавирусом і пикорнавирусоподобной супергрупай (9), якія цяпер аб'яднаны ў нядаўна створаныя Pisonivirites ( 46) у катэгорыі.
Нашы дадзеныя таксама паказваюць, што асноўныя, селектыўныя і кансерватыўныя дзеянні ферментаў, выяўленыя ў гэтым даследаванні, могуць быць выкарыстаны ў якасці мішэняў для супрацьвірусных прэпаратаў.Злучэнні, якія перашкаджаюць звязванню (і наступнай мадыфікацыі) кансерватыўнага N-канца nsp9 у актыўным цэнтры NiRAN, могуць быць распрацаваны ў эфектыўныя і універсальныя супрацьвірусныя прэпараты, прыдатныя для лячэння каранавірусаў жывёл і чалавека розных (пад)родаў інфекцый , уключаючы каранавірус SARS-CoV-2 і блізкаўсходні рэспіраторны сіндром.
Паслядоўнасць кадавання каранавіруснага бялку, атрыманага ў гэтым даследаванні, была ўзмоцнена з дапамогай RT-PCR з выкарыстаннем РНК, выдзеленай з Huh-7, заражанага HCoV-229E, або Vero E6, заражанага SARS-CoV-2, і ўстаўлена з дапамогай стандартных працэдур кланавання.Вектар экспрэсіі pMAL-c2 (біялагічная лабараторыя Новай Англіі) або pASK3-Ub-CHis6 (47) (Дадатак SI, табліцы S1 і S2).Адзінкавыя замены кадонаў былі ўведзены з дапамогай ПЦР на аснове сайт-накіраванага мутагенезу (48).Каб вырабіць зліты бялок MBP, клеткі E. coli TB1 трансфармавалі адпаведнай плазміднай канструкцыяй pMAL-c2 (дадатак SI, табліца S1).Зліты бялок быў ачышчаны з дапамогай амилозной аффинной храматаграфіі і расшчапляецца фактарам Ха.Пасля гэтага С-канцавы His6-пазначаны бялок быў ачышчаны Ni-иммобилизованным металам аффинной храматаграфіі (Ni-IMAC), як апісана раней (49).Каб вырабіць зліты бялок убіквіцін, клеткі E. coli TB1 выкарыстоўвалі адпаведную плазмідную канструкцыю pASK3-Ub-CHis6 (Дадатак SI, табліцы S1 і S2) і плазмідную ДНК pCGI, якая кадуе убіквіцін-спецыфічную С-канцавую гідралазу 1 (Ubp1).Трансфармацыя (47).С-канцавы бялок коронавируса, пазначаны His6, быў ачышчаны, як апісана раней (50).
Тэст самастойнага NMPylation HCoV-229E nsp12-His6 быў выкананы, як апісана ў EAV nsp9 (16).Карацей кажучы, nsp12-His6 (0,5 мкМ) утрымлівае 50 мМ 4-(2-гідраксіэтыл)-1-піперазінэтансульфонавай кіслаты (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 мМ дитиотреитола (DTT), 6 мМ MnCl2, 25 мкМ буфера, інкубуйце паказаны NTP і 0,17 мкМ адпавядаюць [α32-P]NTP (3000 Кі/ммоль; Hartmann Analytic) пры 30 °C на працягу 30 хвілін.Ва ўсіх іншых (стандартных) аналізах NMP-пілявання nsp12-апасродкаванага NMP-пілявання nsp9 ўмовы рэакцыі рэгулююцца наступным чынам: nsp12-His6 (0,05 мкМ) і nsp9-His6 (4 мкМ) у прысутнасці 50 мМ HEPES-KOH (pH 8,0). ), 5 мМ DTT, 1 мМ MnCl2, 25 мкМ паказаны NTP і 0,17 мкМ адпаведны [α32-P]NTP.Пасля інкубацыі на працягу 10 хвілін пры 30 °C, рэакцыйную пробу змяшалі з буферам для ўзору SDS-PAGE: 62,5 ммоль трыс(гідраксіметыл)амінаметан HCl (pH 6,8), 100 ммоль ДТТ, 2,5% раствора SDS, 10% гліцэрыны і 0,005% бромфенолу. блакітны.Бялок быў дэнатураваны награваннем пры 90 °C на працягу 5 хвілін і падзелены 12% SDS-PAGE.Гель фіксуюць і афарбоўваюць растворам Coomassie Brilliant Blue (40% метанолу, 10% воцатнай кіслаты, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), абескаляроўваюць і падвяргаюць ўздзеянню фасфарысцыруючага экрана на працягу 20 гадзін (для выяўлення nsp12 з NMPylation) або (максімум) 2 гадзіны (для ацэнкі nsp9 NMPylation).Для сканавання экрана выкарыстоўваўся прыбор Typhoon 9200 (GE Healthcare), а для аналізу інтэнсіўнасці сігналу - ImageJ.
Для МС-аналізу 1 мкМ nsp12-His6 і 10 мкМ nsp9 (без гексагістыдынавай цэтліка) выкарыстоўваліся ў аналізе NMPylation (дадатак SI, табліца S1) і выкарыстоўваліся павышаныя канцэнтрацыі 500 мкМ UTP і GTP.У залежнасці ад іх канцэнтрацыі і чаканай якасці бялку, сістэма Waters ACQUITY H-Class HPLC, абсталяваная калонкай MassPrep (Waters), выкарыстоўвалася для абяссольвання ад 1 да 10 мкл буферных бялковых раствораў онлайн.Абяссолены бялок элюіруецца ў электрараспыляльную крыніцу іёнаў мас-спектрометра Synapt G2Si (Waters) праз наступны градыент буфера A (вада/0,05% мурашынай кіслаты) і буфера B (ацэтанітрыл/0,045% мурашынай кіслаты), і тэмпература калонкі роўная 60 ° C і хуткасць патоку 0,1 мл/мін: ізакратычнае элюцыя 5% А на працягу 2 хвілін, затым лінейны градыент да 95% Б на працягу 8 хвілін і падтрыманне 95% Б яшчэ 4 хвіліны.
Выяўляюцца станоўчыя іёны з дыяпазонам мас ад 500 да 5000 m/z.Глю-фібрынапептыд B вымяраецца кожныя 45 секунд для аўтаматычнай карэкцыі дрэйфу масы.Выкарыстоўвайце прыборнае праграмнае забеспячэнне MassLynx з пашырэннем MaxEnt1 для дэканволюцыі сярэдняга спектру пасля выліку базавай лініі і згладжвання.
UMPylated HCoV-229E nsp9 расшчаплялі шляхам дадання мадыфікаванага трыпсінаў (Serva) і інкубавалі на працягу ночы пры 37 °C.Спіновая калонка Chromabond C18WP (нумар дэталі 730522; Macherey-Nagel) выкарыстоўвалася для абяссольвання і канцэнтрацыі пептыдаў.Нарэшце, пептыда раствараюць у 25 мкл вады, якая змяшчае 5% ацэтанітрылу і 0,1% мурашынай кіслаты.
Узоры былі прааналізаваны з дапамогай мас-спектрометра Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Канчатковая сістэма nanoâ ВЭЖХ (Dionex), абсталяваная 50 см??Калонка C18 RP памерам 75 мкм, запоўненая магнітнымі шарыкамі памерам 2,4 мкм (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Падключыцеся да мас-спектрометра онлайн праз крыніцу нанараспылення Proxeon;увядзіце 6 мкл раствора для пераварвання трыпсінаў ва ўнутраны дыяметр 300 мкм ×??Калонка для папярэдняй канцэнтрацыі C18 PepMap памерам 1 см (Thermo Scientific).Выкарыстоўваючы ваду/0,05% мурашынай кіслаты ў якасці растваральніка, узор быў аўтаматычна захоплены і апраснены пры хуткасці патоку 6 мкл/мін.
Наступныя градыенты вады/0,05% мурашынай кіслаты (растваральнік А) і 80% ацэтанітрылу/0,045% мурашынай кіслаты (растваральнік В) выкарыстоўваліся для дасягнення падзелу трыптычных пептыдаў пры хуткасці патоку 300 нл/мін: 4% В для 5 хвілін, затым 30 А лінейны градыент да 45% B на працягу некалькіх хвілін і лінейнае павышэнне да 95% растваральніка B на працягу 5 хвілін.Падключыце храматаграфічную калонку да нана-выпраменьвальніка з нержавеючай сталі (Proxeon) і распыліце элюент непасрэдна ў нагрэты капіляр мас-спектрометра, выкарыстоўваючы патэнцыял 2300 В. Апытальнае сканаванне з дазволам 60 000 у аналізатары мас Orbitrap звязана з прынамсі трыма сканаваннямі дадзеных MS/MS, дынамічна выключанымі на 30 секунд, з выкарыстаннем дысацыяцыі, выкліканай сутыкненнем іёнаў, або дысацыяцыі пры сутыкненні з большай энергіяй у спалучэнні з выяўленнем арбітальнай трапецыі. Раздзяленне складае 7500.
Час публікацыі: 3 жніўня 2021 г